Образ невесты Подготовка к свадьбе Организация свадьбы Развлечения на свадьбе Поздравления и тосты на свадьбу Свадебные приметы, горосокопы и гадания

Окрашивание гематоксилин эозином


Гематоксилин — эозин — Практика гистолога

ОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИНОМ — ЭОЗИНОМ

Окраска гематоксилин-эозином — наиболее распространённый метод окрашивания срезов. Этот методпозволяет установить отношения между частями органа, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Практически во всех случаях независимо от поставленной задачи применяется окраска гематоксилин-эозином. В большинстве случаев для изучения структуры нормального или измененного в результате болезни органа ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда перед исследователем стоит специальная задача, пользуются особыми методами, окрашивая в то же время параллельно ряд срезов гематоксилин-эозином.

Эта окраска является двойной: гематоксилин — основной краситель — окрашивает ядра клеток, эозин — кислый краситель — красит протоплазму клеток и в меньшей степени — различные неклеточные структуры.

Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Эозин — искусственная краска. Растворы красителей должны быть приготовлены заранее. Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество — гематеин. В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер (используют гематоксилин Эрлиха, Майера, железный гематоксилин Гейденгайна).

Эозин — протоплазматический краситель; используется он в виде спиртовых или, гораздо чаще, водных растворов. Для приготовления эозина 0,1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Подготовка срезов к окраске заключается в их кратковременной обработке спиртом. Поскольку при заливке в парафин или целлоидин материал обезвоживается в спиртах, срезы, полученные при этих способах заливки, в особой подготовке для окраски гематоксилин-эозином не нуждаются. Обрабатывать необходимо замороженные срезы. При этом происходит их обезжиривание и другие изменения в структуре, что значительно улучшает окрашивание гематоксилин-эозином. Срезы обрабатывают в 96° спирте не более 3-5 минут. Из спирта срезы переносят обратно в дистиллированную воду. Окраску производят сначала гематоксилином.

 

Порядок проведения окраски:

 

Дистиллированная вода ополоснуть
Раствор гематоксилина 1-20 мин
Солянокислый спирт дифференцировка
Аммиачная вода срезы синеют (контроль под микроскопом)
Проточная вода 5-10 мин
Дистиллированная вода ополоснуть
Раствор эозина 10с-3 мин
Спирт 96%, карбол-ксилол, заключение

 

Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.

Примеры практических микропрепаратов, окрашенных гематоксилином-эозином:

 

Рис. 1, 2. Болезнь Фара (феррокальциноз). В веществе головного мозга из зоны подкорковых ядер зональное обызвествление (практически без признаков склероза) стенок небольших сосудов (капилляров, мелких артерий и артериол) различной степени выраженности (от пылевидного включения солей кальция в толще стенки до полного замещения сосудистых стенок кальцинатами). Вдоль стенок большинства капилляров густо расположены небольшие округло-овальные кальцинаты по типу псаммом, вокруг отдельных капилляров образованы целые муфты петрификатов.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.

Рис. 3, 4. Болезнь Фара (феррокальциноз, другое наблюдение). Крупные группы густо расположенных мелких сосудов с наличием циркулярного пылевидного и в виде мелких гранул кальциноза стенок, расположенного между адвентицией сосудов и средней их оболочкой, в толще средней оболочки, полностью замещающего сосудистую стенку. Видны фрагменты сосудистых стенок в косопоперечном, продольном срезе, утолщенные кальцифицированные стенки выглядят как «кусочки вермишели».

Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.

Рис. 5. Очаговый интрамуральный кардиосклероз. Сохранившиеся кардиомиоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, выраженной гипертрофии.

Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Рис. 6. Умеренная-выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, белковая зернистая их дистрофия. В цитоплазме ряда кардиомиоцитов вокруг ядер расположены мелкие скопления золотисто-жёлтого «пигмента старения» липофусцина. Очаговая круглоклеточная инфильтрация стромы. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.

Рис. 7, 8. Грибковый перикардит (острый гнойно-фибринозный), группа гиалогифомикозов. Очаги выраженной лейкоцитарной инфильтрации с включениями относительно рыхлого фибрина на фоне очагово-диффузных диапедезно-деструктивных кровоизлияний расположены в эпикарде и субэпикардиальной жировой ткани. Здесь же расположены колонии грибковой микрофлоры, относящейся к гиалогифомикозам: хорошо окрашены гематоксилином-эозином, гифы в диаметре около 2-3 мкм, разрастаются пучками от центрального фокуса в виде «кустарника». Некоторые гифы дихотомично делятся. Мицелий септированный.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Рис. 9, 10. Метастазы плоскоклеточного рака в миокард, субэпикардиальную жировую ткань. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Рис. 11. Актиномикоз лёгкого с перифокальной картиной очаговой острой гнойной пневмонии.

Окраска: гематоксилин и эозин.

Увеличение х100.

Рис. 12. Лёгочная миграция личинки аскариды. В просвете альвеолы червеобразная структура розового цвета, свёрнутая в клубок, с признаками её движения (тонкие перифокальные полоски просветления в реактивном гнойном экссудате).

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

 

 

 

 

Рис. 13-15. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания древовидного мицелия с перифокальной острой гнойно-фибринозной пневмонией. В отдельных полях зрения видны спорангии со спорами.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА, Свердловским ОБСМЭ.

 

 

Рис. 16, 17. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания мицелия с большим количеством спороносцев.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.

Рис. 18. Криптококкоз лёгкого.

Окраска: гематоксилин и эозин.

Увеличение х100.

Рис. 19. Криптококкоз печени.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Рис. 20, 21. Печень. Очаговое острое гнойное межуточное воспаление с преобладанием эозинофилов. Очаговое выраженное полнокровие синусоидных капилляров и центральных вен с эритростазами, диапедезными микрогеморрагиями. Гепатоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, мелко — и крупнокапельной жировой дистрофии. Часть печёночных клеток в состоянии некробиоза-некроза.

Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.

Рис. 22. Выраженная очаговая гидропическая дистрофия гепатоцитов, сочетающаяся с мелко — и крупнокапельной жировой дистрофией печёночных клеток. Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Рис. 23. Гигантоклеточный гепатит. Неравномерное полнокровие синусоидных капилляров. Белковая зернистая дистрофия, признаки неравномерно выраженной их регенерации в виде деления ядер и самих клеток. Диффузно в срезах в большом количестве расположены гигантские многоядерные макрофаги.

Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА

Рис. 24, 25. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз ткани печени. Большое количество клеток Купфера с цитоплазмой, нагруженной большим количеством буро-коричневого пигмента. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.

Рис. 26-29. Почка с резко выраженной белковой зернистой дистрофией, гидропической (вплоть до баллонной) дистрофией эпителия канальцев, с некробиозом-некрозом отдельных эпителиоцитов и групп клеток различной величины, атрофией ряда канальцев различной степени выраженности. Наличие в просветах части канальцев свежих ярко-красных эритроцитов (гематурия) и выщелоченных эритроцитов, гиалиновых цилиндров, слущенных эпителиоцитов.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Рис. 30, 31. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз селезёнки.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Рис. 32, 33. Светлоклеточный рак почки.

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.

Препарат представлен экспертом Ким С.В..

Окрашивание гематоксилином и эозином: принцип, процедура и интерпретация

Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) является наиболее распространенным методом окрашивания в гистопатологии. При этом используется комбинация двух красителей, гематоксилина и эозина, используемая для демонстрации ядерных и цитоплазматических включений в клинических образцах.

Принцип

Квасцы действуют как протрава, а квасцы, содержащие гематоксилин, окрашивают ядро ​​в голубой цвет. В присутствии кислоты он становится красным, поскольку дифференциация достигается обработкой ткани раствором кислоты.На этапе воронения исходный растворимый красный цвет внутри ядра преобразуется в нерастворимый синий цвет. Контрастное окрашивание проводится с помощью эозина, придающего цитоплазме розовый цвет.

Реагенты

    1. Окраска гематоксилином Харри

A = 1 г гематоксилина в 10 мл этанола
B = 20 г квасцов аммония в горячей дистиллированной воде
Смешайте A и B, вскипятите и добавьте 0,5 г ртути оксид и фильтр.

    1. Раствор эозина

Желтый эозин = 1 г
Дистиллированная вода = 80 мл
Этанол = 320 мл
Ледяная уксусная кислота = 2 капли

  1. 0.5% HCl
  2. Разбавьте аммиачную воду

Процедура

  1. Депарафинизируйте секцию: подожгите задвижку на горелке и поместите в ксилол. Повторите лечение.
  2. Гидратация: Гидратация участка ткани путем использования спиртовых ванн и воды со снижающейся концентрацией. (100%, 90%, 80%, 70%)
  3. Окрашивание в гематоксилине в течение 3-5 минут
  4. Промойте в проточной водопроводной воде до тех пор, пока участки не станут «синими» в течение 5 минут или меньше.
  5. Дифференцировать в 1% кислотном спирте (1% HCl в 70% спирте) в течение 5 минут.
  6. Промойте проточной водой из-под крана до тех пор, пока секции снова не станут синими, погрузив их в щелочной раствор (например, аммиачную воду) с последующей промывкой водопроводной водой.
  7. Окрашивание в 1% -ном эозине Y в течение 10 минут
  8. Промывание в водопроводной воде в течение 1-5 минут
  9. Обезвоживание с возрастающей концентрацией спиртов и очистка в ксилоле
  10. Крепление в монтажной среде
  11. Наблюдать под микроскопом

Результат и Интерпретация

Ядра : синий, черный

Цитоплазма : розовый

Мышечные волокна : темно-красный

RBCs : оранжево-красный

Фибрин : темно-розовый

.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E): принцип, процедура и интерпретация

Home ГИСТОПАТОЛОГИЯ Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E): принцип, процедура и интерпретация Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) является наиболее широко используемым методом окрашивания в гистопатологии. Как следует из названия, краситель H&E использует комбинацию двух красителей, а именно гематоксилина и эозина. Эта комбинация должным образом окрашивает различные тканевые элементы и делает их удобными для наблюдения.

Принцип

Принцип окрашивания H&E заключается в химическом притяжении ткани и красителя. Гематоксилин , основной краситель, придает сине-фиолетовый контраст базофильным структурам, в первую очередь тем, которые содержат фрагменты нуклеиновых кислот, такие как хроматин, рибосомы и участки цитоплазмы, богатые РНК. Кислый эозин окрашивает основные элементы, такие как эритроциты, цитоплазма, мышцы и коллаген, различной интенсивности розового, оранжевого и красного цвета.

Требования

  1. Окраска гематоксилином Харри
    A = 1 г гематоксилина в 10 мл этанола
    B = 20 г квасцов аммония в горячей дистиллированной воде
    Смешайте A и B, вскипятите и добавьте 0.5 г оксида ртути и фильтр.
  2. Раствор эозина
    Желтый эозин = 1 г
    Дистиллированная вода = 80 мл
    Этанол = 320 мл
    Ледяная уксусная кислота = 2 капли
  3. 0,5% HCl
  4. Разбавленная аммиачная вода

Процедура

  1. Депарафинизация : запустите заслонку на горелке и поместите в ксилол. Повторите процедуру, чтобы удалить воск.
  2. Hydration : Осушите ксилол и увлажните участок ткани, пропустив его через спиртовые ванны с уменьшающейся концентрацией (100%, 90%, 80%, 70%) и воду.
  3. Ядерное окрашивание : Окрашивать гематоксилином в течение 3-5 минут.
  4. Промойте в проточной водопроводной воде, пока участки не станут синими в течение 5 минут или меньше.
  5. Дифференциация : выборочное удаление лишнего красителя с участка). Окунитесь в 1% -ный спирт (1% HCl в 70% -ном спирте) на несколько секунд.
  6. Синий : промойте в проточной водопроводной воде. Окуните в аммиачную воду, пока секции не станут синими, а затем промойте водопроводной водой.
  7. Контркрашивание : Окрашивание в 1% эозине Y в течение 10 минут.
  8. Промыть в водопроводной воде 1-5 минут.
  9. Дегидратация : Дегидратация спиртов с возрастающей концентрацией.
  10. Очистка : Поместите предметные стекла в две ванны с ксилолом для очистки.
  11. Монтаж : Монтаж в DPX или другом монтажном носителе.
  12. Наблюдать под микроскопом.

Результаты и интерпретация

  • Ядра: синие, черные
  • Цитоплазма: розовая / пурпурно-розовая
  • Мышечные волокна: темно-красный
  • RBC: оранжево-красный
  • Кальций: темно-синий
  • Mucin: Серо-синий

Dhurba Giri - разработчик и участник LaboratoryTests.org . Он - технолог медицинской лаборатории и научный блогер из Покхары, Непал. Свяжитесь с ним:

.

Ткани, окрашенные гематоксилином и эозином

Использование цветного изображения светлого поля с Cytation ™ 5 для изображения фиксированных и окрашенных тканей


Автор : Пол Хелд, доктор философии, руководитель лаборатории, отдел приложений, BioTek Instruments, Inc., Виноски, VT

Визуализация и анализ меченых фиксированных и хромогенно окрашенных клеток традиционно выполнялись вручную исследование предметных стекол с помощью многообъективного поэтапного микроскопа.С появлением цифровых цветных изображений светлого поля можно автоматически получать изображения образцов и сохранять данные для исследования независимо от микроскопа. Здесь мы описываем использование Cytation 5, недорогого и дорогостоящего комбинированного устройства для визуализации клеток и ридера для микропланшетов, для быстрого изображения слайдов тканей, окрашенных гематоксилином и эозином.

Введение

Исследование хромогенно окрашенных тканей было отличительной чертой клинической диагностики патологии и исследований рака на протяжении почти столетия.Фиксированная и окрашенная ткань на предметных стеклах микроскопа была обычно используемым методом хранения данных. Патологические образцы, которые необходимо было просмотреть, обычно фиксировали и заливали парафином для длительного хранения. Затем из образцов парафина были сделаны тонкие срезы, иммобилизованные на предметных стеклах, депарафинизация и последующее окрашивание, обычно гемотоксилином и эозином, и закрытые покровным стеклом. Исследование патологического предметного стекла потребовало, чтобы исследователь использовал поэтапный многообъективный микроскоп для своих наблюдений.После исследования предметное стекло вместе с залитой парафином тканью обычно архивировали для последующего повторного исследования. Если требовалось повторное исследование, необходимо было извлечь предметное стекло или зафиксированную парафином ткань повторно обработать и сделать новое предметное стекло перед повторным исследованием. С развитием цифровых изображений и хранения данных цветные изображения становятся все более желательными.

Рис. 1. Гематоксилин и эозин окрашивали нормальную ткань тонкой кишки человека.

Комбинация красителей гематоксилин и эозин (H&E) была впервые использована для окрашивания тканей в 1876 году химиком Виссовски (1). Гематоксилин или, точнее, его окисленная форма гематин связывается с протравой (обычно Al3 +), окрашивая ДНК в клеточном веществе. Считается, что он связывается с отрицательно заряженными фосфатными группами, которые составляют основу ДНК, а затем претерпевает сложную координацию или конъюгацию, чтобы стать стойким пятном ядра. Вместе с протравой Al3 + краситель дает синий цвет в нейтральных или основных условиях (рис. 2).

Рисунок 2. Связывание гематоксилина (гематина) с ДНК в ядре клетки.

И наоборот, анионный эозин Y будет связываться с положительно заряженными группами белков, такими как аминогруппы. Остатки лизина, например, имеют ε-аминогруппу с pKa в диапазоне 10, так что они будут оставаться в виде положительных ионов на протяжении всего процесса окрашивания (рис. 3).

Рис. 3. Структура дианиона, эозина Y, используемого при окрашивании H&E.

Хотя были разработаны другие окрашивания и протоколы окрашивания клеток и срезов тканей, первоначальный метод, разработанный почти 140 лет назад, остается относительно неизменным. Гематоксилин даже не производится синтетически, а извлекается из бревна. Несмотря на это, окрашивание H&E остается наиболее распространенным протоколом окрашивания для применения в гистологии.

В этой статье мы продемонстрируем полезность нового автоматизированного цифрового микроскопа для получения изображений срезов тканей, окрашенных H&E.Увеличение срезов от малого до большого возможно благодаря программному выбору объективов микроскопа в диапазоне от 2,5 до 60x. Все настройки фокусировки и экспозиции автоматизированы, что упрощает работу. Изображения в реальном времени просматриваются на мониторе компьютера, а желаемые изображения можно сохранять и загружать в виде ряда различных файлов данных, включая TIF и PNG, упрощающие обмен данными.

Материалы и методы

Коммерчески доступные фиксированные и окрашенные срезы тканей нормального кишечника и почек человека, а также почки человека с хроническим нефритом были приобретены у Konus.Слайды получали с помощью считывающего устройства Cytation ™ 5 Cell Imaging Reader. Перекрытие монтажных интервалов было установлено по умолчанию для сшивания в программном обеспечении Gen5 +. Серия цветных монтажных изображений светлого поля (12 x 8) и отдельных фрагментов изображения, сшитых с использованием линейного смешения по перекрывающимся частям каждого фрагмента изображения. Регистрация была произведена с использованием красного канала, и получившийся файл был уменьшен до 25% от максимального размера.

Результаты

Способность Cytation 5 окрашивать фиксированные светлопольные изображения и окрашенные H&E срезы тканей продемонстрирована на Рисунке 4, где сравниваются нормальные и больные почки.С помощью монтажа объектива 60X изображения слайдов были захвачены, записаны, и отдельные фрагменты изображений сшиты для формирования отдельных непрерывных файлов изображений для каждого слайда. Заметная инфильтрация лимфоцитов в интерстициальные пространства идентифицируется по значительному окрашиванию гематоксилиновым синим. На гиалинизацию клубочков указывает окрашивание аморфным розовым эозином капсул Боумена. В клубочках нормальной почечной ткани видны открытые пространства Боумена и отсутствуют воспалительные клетки.

Рисунок 4. Сравнение нормальной и больной почки человека. Окрашенная гематоксилином и эозином ткань из нормальной почки (A) и почки с хроническим нефритом (B). Изображения представляют собой сшитый монтаж 12 x 8, сделанный с использованием объектива 60x. Масштабная линейка представляет 200 мкм.

Массивы Montage позволяют захватить большую площадь, чем один кадр изображения. Отделяя изображения друг от друга, можно использовать массивы для получения отдельных фрагментов из разных областей слайда. Каждый будет изучен и проанализирован отдельно.В качестве альтернативы с небольшим перекрытием отдельные изображения могут быть объединены для создания более крупной непрерывной композиции. При увеличении увеличения получается больше информации, хотя и на гораздо меньшей области. Размер исследуемой области слайда зависит от используемого увеличения. Степень, с которой Cytation ™ 5 может увеличивать область слайда, продемонстрирована на рисунке 5, где срез ткани кишечной стенки человека был получен с использованием объективов 2,5 и 60. Монтаж объектива с 2,5-кратным увеличением показывает весь срез ткани как небольшую часть всего изображения.Также можно различить край круглого покровного стекла. Область изображения слайда изображена на графике слайда, представленной программным обеспечением Gen5 ™. Монтаж объектива с 60-кратным увеличением - это очень маленькая часть изображения с 2,5-кратным увеличением. Указывается расположение этого изображения в контексте всего среза ткани вместе с гораздо меньшей областью слайда.

Рис. 5. Максимальное увеличение с использованием считывающего устройства для микропланшетов Cytation 5 Imaging. Фиксированный и окрашенный срез ткани стенки кишечника человека, иммобилизованный на слайде размером 1 x 3 дюйма, был отображен с помощью 2.Объективы 5x и 60x для создания монтажа 12 x 8. Затем монтажные плитки были сшиты методом линейного наложения с регистрацией красного канала. Последующий файл изображения был уменьшен до 25% от максимума. Указывается область ткани из 2,5-кратного изображения, увеличенного с помощью объектива 60-кратного увеличения, а также область слайда, отображаемая при каждом монтаже со схемой слайда.

Рисунок 6 демонстрирует удобство многообъективной револьверной системы Cytation 5. Тот же фиксированный и окрашенный слайд пораженной ткани почек человека был визуализирован с использованием цветного светлопольного монтажа (12 x 8) при шести различных увеличениях (2.От 5x до 60x) без вмешательства. Область, полученная при следующем увеличении, определяется для каждого изображения. Поскольку Cytation 5 использует 6-позиционную револьверную систему, можно запрограммировать различные шаги увеличения для областей скольжения для автоматического позиционирования, фокусировки и визуализации без какого-либо вмешательства пользователя. Как и на предыдущем рисунке, весь срез ткани можно наблюдать в низком разрешении с изображениями с меньшим увеличением. С увеличением увеличения появляется большее разрешение микроскопических деталей.После просмотра результатов можно выбрать лучшее увеличение для демонстрационных целей.

Рисунок 6. Макроскопическая и микроскопическая структура ткани почек человека при хроническом нефрите. Серии монтажных изображений (12 x 8) при увеличении были записаны и сшиты из одного и того же среза ткани. Область в рамке представляет собой область, отображаемую на следующем изображении с большим увеличением. Увеличение объектива и масштабная линейка присутствуют для каждого монтажа.

Результаты

Считывающее устройство для микропланшетов Cytation ™ 5 в сочетании с программным обеспечением Gen5 ™ имеет несколько функций, которые помогают в автоматическом отображении слайдов окрашенных тканей. Слайды можно создавать как вручную, так и в автоматическом режиме. Ручная визуализация позволяет исследователю вручную манипулировать носителем, когда он находится внутри считывателя, используя программные средства управления Gen5 или внешний джойстик. После того, как интересующая область была идентифицирована, одноцветные или монтажные цветные изображения в светлом поле могут быть захвачены и сохранены, а изображения сшиты и проанализированы в полях программного обеспечения ручного режима Gen5.В качестве альтернативы слайды можно читать с помощью автоматизированной процедуры. Перед визуализацией можно запрограммировать положение слайда, объектив увеличения и матрицу монтажа (до матрицы 15 x 15). Несколько шагов чтения могут использоваться для определения различных целей и / или различных областей слайда, которые будут отображены в одном эксперименте.

Важным атрибутом цветного светлого поля является баланс белого. Баланс белого - это процесс удаления нежелательных цветовых оттенков, так что белые объекты становятся белыми на изображении.При правильной балансировке необходимо учитывать цветовую «температуру» или относительную теплоту или прохладу источника света. Человеческий глаз гораздо более искусен, чем цифровой датчик, при оценке белого в различных условиях освещения, поэтому важно, чтобы он был автоматически сбалансирован для достижения правильной цветопередачи во время получения цветных изображений светлого поля. Цветовой баланс достигается путем измерения и настройки вывода трех цветных каналов светлого поля независимо от фактического образца, чтобы гарантировать их эквивалентность.Этот процесс выполняется Gen5 автоматически для каждого набора из трех сделанных цветных изображений. После выполнения балансировки белого уровни освещенности фиксируются и не изменяются на этапе считывания.

Объективы с малым увеличением, такие как 2,5х и 4х, имеют большую глубину резкости. Когда эти объективы используются для цветного монтажа изображений светлого поля, Cytation 5 будет использовать автофокус только перед первым изображением, что значительно экономит время при больших монтажах. Объективы с большим увеличением и меньшей глубиной резкости требуют автофокусировки для каждого изображения, поскольку небольшие отклонения плоскостности слайда или толщины образца могут привести к нечетким изображениям.При визуализации образца вручную пользователь естественным образом регулирует фокус при каждом движении тепловизора. И наоборот, при работе в автоматическом режиме инструмент должен иметь возможность регулировать фокус без вмешательства, чтобы получить хорошие изображения, необходимые для дальнейшего анализа. Процесс автофокусировки отличается в флуоресцентной и цветной светлопольной микроскопии.

Автофокусировка на основе флуоресценции использует статистический алгоритм на основе изображения, который оценивает контраст путем измерения стандартного отклонения и / или корреляции между соседними пикселями для определения оптимального фокуса [2].По мере приближения инструмента к точке фокусировки разница в сигнале между пикселями истинного изображения и фона резко возрастает, таким образом, увеличивается стандартное отклонение всех пикселей. График стандартного отклонения пикселей в зависимости от высоты по оси Z дает резкий пик в точке фокуса [3]. Преимущество использования статистического алгоритма, такого как стандартное отклонение, - это ширина объекта. Контрастность изображения начинает увеличиваться вдали от фокуса, что дает более широкий диапазон, в котором результаты поиска позволяют успешно найти оптимальный пиковый контраст [3-4].

В то время как флуоресцентные изображения имеют очень резкие различия между фоном и изображением, цветная автофокусировка светлого поля представляет собой уникальные проблемы с автофокусировкой. Визуализация в светлом поле имеет значительно меньший общий контраст, а также менее четко определенные границы цели и несколько фокальных плоскостей от отражений, мениска и толстых образцов. При цветном изображении светлого поля сканирование стандартного отклонения в зависимости от высоты объектива по оси Z показывает двойной пик, когда толщина образца превышает глубину резкости, что является обычным для объективов в 10 раз и более.Для получения однородных изображений необходимо выбрать один и тот же пик. Cytation ™ 5 использует алгоритм «двойного пика» для выбора более высокой фокальной плоскости правого более высокого пика оси Z. Вкратце, сканирование выполняется с использованием обнаружения контраста или краев. Вычисляется производная сканирования и выбирается пересечение нуля, соответствующее впадине между двумя пиками. Теперь алгоритм ищет пиковое значение «обнаружения края» справа от пересечения нуля. Затем изображение снимается на верхнем максимуме оси Z при вычислении обнаружения края.Эта процедура гарантирует, что одна и та же точка фокусировки всегда используется для последующих изображений, делая фокусировку резкой и повторяемой.

Список литературы

  1. Wissowzky A. Ueber das Eosin als reagenz auf Hämoglobin und die Bildung von Blutgefässen und Blutkörperchen bei Säugetier und Hühnerembryonen. Archiv für mikroskopische Anatomie 1876 г .; 13: 479-496.
  2. Sun, Y., Duthaler, S. Nelson, B.J. (2004) Автофокусировка в компьютерной микроскопии: выбор оптимального алгоритма фокусировки.Microsc. Res. Tech. 65, 139–149.
  3. Groen, F. Young, I.T. & Lignart, G. (1985) Сравнение различных функций фокусировки для использования в алгоритмах автофокусировки. Цитометрия 6, 81-91.
  4. Йео, Т., Джаясориа, Р. (1993) Автофокусировка для микроскопии тканей. Изображение Vis. Comput. 11, 629-639.

AN103114_20

.

Гематоксилин и эозин (H&E Stain)

00:00 Давайте теперь посмотрим на основы окрашивания гематоксилином и эозином. 00:08 Уже окрашивая предметное стекло после его подготовки используя технологию, которую я кратко рассмотрел в первой части этой лекции, давайте посмотрим на окрашивание.00:22 Гематоксилин и эозин - наиболее часто используемые красители в гистологии. 00:28 Пример этого находится на изображении справа. 00:32 Это обычный слайд, который я использовал на предыдущей лекции.00:38 Гематоксилин - базовый краситель. 00:41 Его цветная часть имеет чистый положительный заряд, тогда как эозин представляет собой кислотный краситель или кислотный краситель.00:54 Его цветная часть имеет чистый отрицательный заряд, а на правой стороне - ненадолго. когда вы используете гематоксилин и эозин, он окрашивает разные компоненты в разные цвета. 01:10 Не вдаваясь в подробности, гематоксилин производит то голубоватое пятно, которое вы видите. связанные с теми компонентами в ткани, через которые мы пройдем через мгновение тогда как эозин окрашивает компоненты ткани в розово-красный цвет, и это то, что вы обычно видите на большинстве слайдов в блоке слайдов класса.01:34 Давайте просто попробуем понять, что мы подразумеваем под термином базофилия. 01:41 Основные красители, такие как гематоксилин, вступят в реакцию с анионными компонентами клеток и тканей, то есть те, которые несут чистый отрицательный заряд.01:57 Итак, когда мы смотрим на анионные компоненты клеток и тканей, когда они реагируют с основным красителем, эти компоненты, как говорят, проявляют базофилию, и базофилия или степень базофилии действительно реагирует или зависит от pH, используемого в процессе окрашивания.02:26 Некоторые из анионных компонентов клеток или тканей, которые вступают в реакцию с основным красителем. карбоксильные группы белков, фосфатные группы нуклеиновых кислот, и сульфатные группы гликозаминогликанов. 02:44 И я, конечно, не хочу вдаваться в химию всех этих компонентов в этой лекции.02:49 Просто чтобы дать вам основу для того, что Используемая техника окрашивания на самом деле нацелена на компоненты ткани. 03:00 Если вы используете pH около 10, все эти анионные компоненты будут поглощать основной краситель.03:10 Если вы ограничите pH от 5 до 7, другими словами, от слабокислой до нейтральной, тогда вы будете окрашивать только эти компоненты ткани или клеток. 3:26 И если вы ограничите pH ниже 4, тогда вы собираетесь только взять пятно сульфатных групп гликозаминогликанов.3:41 С другой стороны, кислотные красители, давайте просто определим, что мы подразумеваем под ацидофилией. 3:48 Кислотные красители, такие как эозин, вступают в реакцию с катионными компонентами клеток и тканей. особенно ионизированные аминогруппы белков.04:03 Итак, ацидофилия, когда мы смотрим на катионные компоненты клеток и тканей, которые реагируют с кислотным красителем, таким как эозин, тогда говорят, что эти компоненты проявляют ацидофилию. 04:21 В случае реакции с эозином, мы иногда называем их эозинофильными, а также ацидофильными.04:33 Одна проблема или одна проблема, связанная с ацидофилией, заключается в том, что реакции не столь специфичны. как реакции с основными красителями, такими как гематоксилин. 04:45 Давайте еще раз посмотрим на несколько слайдов.04:47 Вы видели то, что слева, а теперь еще одно справа. 04:53 Ткань имела очень темно-синий оттенок. Это хрящ. 04:58 И что он делает, так это показывает базофилию, и это покажет количество веществ в клетках и другие внешние части клеток, которые могут проявлять базофилию который вы встретите в своем курсе гистологии и показан здесь.05:24 Например, верхняя часть, на которую вы смотрели раньше. 05:29 Все ядра, окрашенные гематоксилином потому что гетерохроматин, а также ядрышки содержат ионизированные фосфатные группы в нуклеиновых кислотах.05:48 Эндоплазматический ретикулум клеток часто собирательно называют эргастоплазмой а также рибосомы содержат ионизированные фосфатные группы на рибосомных РНК. 06:07 Они также проявляют базофилию. поэтому они собираются окрасить голубоватое пятно основным красителем гематоксилином.06:18 И я покажу вам пример через мгновение, потому что часто бывает трудно увидеть эндоплазматический ретикулум и даже рибосомы в клетках, где они могут производить белковые компоненты которые могут быть эозинофильными и полностью доминировать в цитоплазме клетки.06:34 И, наконец, внеклеточный материал, такой как хрящевой матрикс. также содержит много ионизированных сульфатных групп в своих нуклеиновых кислотах, и вы увидите справа пример хрящевой матрицы, которая демонстрирует базофилию.06:53 Он реагирует с основным красителем или гематоксилином. 06:58 Ацидофилия или когда мы используем эозин, это иногда называют эозинофилией, это окрашивание может показывать ряд различных тканей.07:14 Это может проявляться в различных тканях тела. 07:18 Например, в правой части этого изображения мы видим клетки гладких мышц. 07:25 Это однородный кусок ткани с розовыми пятнами, который вы видите справа.07:30 Таким образом, эти цитоплазматические волокна проявляют эозин или ацидофилию. внутри клетки, такие как сократительные нити, сократительные белки. 07:44 Также внутри клеток некоторые из мембранных компонентов клеток, всегда трудно увидеть в световой микроскоп, они также будут проявлять эозинофилию или ацидофилию и окрашиваться красителем эозином.08:00 А в левой части этого изображения вы можете видеть внеклеточные волокна в случае коллагена, это и снова эти ионизированные аминокислотные группы проявляют ацидофилию и окрашивают это розовое пятно эозином. 8:21 Опять же, цитоплазматические нити в волокнах скелетных мышц проявляют ацидофилию.8:28 А вот пример, где вы можете увидеть, как оба красителя используются вместе, чтобы различать типичные компоненты клеток. опять же, как я упоминал ранее, вы встретите их в большинстве своих гистологических срезов. 8:44 Слева - разрез желудка.8:49 Здесь вы можете увидеть несколько различных особенностей окрашивания. 8:54 Например, на самой поверхности вы видите эти наросты эпителия. 09:00 Не беспокойтесь о деталях.И эти инвагинации имеют на поверхности прозрачные окрашивающие слизистые клетки. 09:10 Эта слизь теряется во время обработки. 09:14 Он теряется во время обезвоживания спиртом обработки, о котором я говорил ранее. и, следовательно, там не на чем красить, так что это выглядит очень четко.09:29 Внизу в ткани вы видите популяцию клеток, окрашенных в розовый цвет. и популяция клеток, окрашенных в голубоватый цвет, с несколькими клетками, окрашенными в бледный цвет, в середине. 09:42 Это клетки, которые проявляют ацидофилию и базофилию, окрашиваясь эозином или гематоксилином.09:52 Перейдите к правому изображению, где вы видите часть этой ткани. 09:58 Это разрез желудка при большем увеличении. 10:05 Клетки, окрашенные в очень темный розовый цвет, демонстрируют ацидофилию или эозинофилию.10:14 Они эозинофильные, реагируют с эозиновым красителем. 10:21 И многие причины, по которым эти клетки окрашиваются в ярко-розовый цвет, заключаются в том, что они полны митохондрий, которые являются эозинофильными или ацидофильными компонентами клеток, и эти митохондрии очень важны в производстве соляной кислоты, которая является продуктом желудка.10:43 Более голубоватые клетки внизу демонстрируют базофилию. 10:53 Окраска ядер очень темно-фиолетового цвета, и здесь вы видите, что цитоплазма, в отличие от только что упомянутых мною окрашенных в красный цвет клеток, которые называются париетальными клетками, очень бледно-голубые клетки, которые вы видите у основания, они главные клетки желудка.11:15 Они синтезируют пепсиноген а для этого нужна огромная фабрика эндоплазматического ретикулума. 11:25 И если вы помните, несколько минут назад я сказал, что эндоплазматический ретикулум очень базофильный, и вы видите это здесь ясно, потому что он доминирует в цитоплазме клетки.11:39 И последнее, что касается обработки тканей. внутри этой ткани, которую вы видите справа, вы можете видеть небольшие пряди белесых участков. 11:52 Обычно это межстраничное пространство, но на этом слайде оно преувеличено. и это сильно преувеличено на ваших участках с пятнами H & amp; E, это потому, что когда вы разрезаете тонкий кусочек ткани и пропустить его через дегидратацию через спирты, это часто приводит к разной усадке различных компонентов ткани, приводя к тому, что мы видим здесь как ложные пробелы.12:23 На самом деле они не встречаются в реальной жизни экземпляра. 12:27 Они продукт переработки, и вы встретите ряд деталей в срезах ваших тканей - Я не буду здесь их рассматривать - которые являются продуктом обработки тканей, либо дифференциальная усадка, либо чрезмерное окрашивание и, как следствие, выпадение пятна, все эти ошибки обработки, если хотите, называются артефактами.12:54 Они не являются истинным отражением реальной структуры. 12:59 Они являются продуктом переработки тканей.

.

Смотрите также



Образ невесты Подготовка к свадьбе Организация свадьбы Развлечения на свадьбе Поздравления и тосты на свадьбу Свадебные приметы, горосокопы и гадания
Club Brides - Клуб Невест

Как показывают статистика и практика, в подавляющем большинстве случаев именно невеста является главным идеологом и главной движущей силой процесса подготовки к свадьбе.
Как подобрать счастливую дату свадьбы, как стильно и оригинально оформить свадебные приглашения, как выбрать самое красивое свадебное платье, какую сделать прическу, каким должен быть букет невесты, во что одеть подружек невесты, где организовать банкет, как оформить банкетный зал, какого фотографа и видеооператора пригласить… Вопросов при подготовке к свадьбе возникает сотни… Без совета и помощи не обойтись.
Свадебный портал «Клуб Невест» (Club Brides) посвящен всем самым главным вопросам, которые возникают у будущих молодоженов в процессе подготовки к свадьбе, а также всем тем вопросам и нюансам, которые необходимо учесть, чтобы свадьба стала действительно красивым, ярким, веселым и запоминающимся событием.
Мы подскажем вам, как подобрать счастливую дату свадьбы, как стильно и оригинально оформить свадебные приглашения, как выбрать самое красивое свадебное платье, какую сделать прическу, каким должен быть букет невесты, во что одеть подружек невесты, где организовать банкет, как оформить банкетный зал, какого фотографа и видеооператора пригласить и многое-многое другое…


2015- © Club Brides - Клуб Невест | Содержание | Карта сайта
Копировать материалы без размещения прямой активной ссылки на CLUBBRIDES.RU запрещено!